Célja, in vitro Kromoszóma-rendellenesség (CA) teszt strukturális kromoszóma-rendellenességeket (klasztogenezist) okozó anyagok azonosítására 2) 3) 4) Különböző mechanizmusok hozzák létre. Ezeknek a változásoknak a többsége végzetes lesz a sejt számára az indukciót követő első néhány sejtciklus során, de nem halálos változások, például reciprok transzlokációk, inverziók és kisebb deléciók jelenlétének jelzésére szolgálnak.
Ezeknek a finomabb változásoknak jelentős következményei lehetnek mind a csíra, mind a szomatikus sejtekben. Tehát a kromoszóma mutációk és a kapcsolódó események okozzák számos emberi genetikai betegséget, és számottevő bizonyíték van arra, hogy ezek a változások az emberi rákban és a kísérleti rendszerekben is szerepet játszanak. A klasztogenitás tesztelésének másik vizsgálata a Micronucleus Assay.
|
protokoll |
|
|
Sejtvonalak |
Kínai hörcsög V79 sejtek ill stimulált tenyésztett humán perifériás vér limfociták |
|
Három pont |
A klastogenitás meghatározása a metafázisos sejtek mikroszkópos értékelésével A sejt életképességének meghatározása a sejtszám (V79 sejtek) vagy a mitotikus index (humán limfociták) relatív növekedésével |
|
Koncentrációk |
Legalább 3 vizsgálati tétel koncentráció párban Maximális koncentrációk: Vegyszerek: 2 mg / ml, 2 µL / ml vagy 10 mM, attól függően, hogy melyik a legalacsonyabb (5 mg / ml / UVCB a nem meghatározott összetevőknél) Orvosi eszköz: 100% kivonat Gyógyszerek: 0,5 mg / ml vagy 1 mM, amelyik a legalacsonyabb |
|
Kitettségi idő |
I. kísérlet: 4 órás rövid távú inkubálás II. Kísérlet: 21 óra (V79 sejtek) vagy 24 óra (humán limfociták) tartós inkubáció |
|
Metabolikus aktiváció |
5% patkány máj homogenizátum S9 |
|
Minőségellenőrzések |
Negatív kontroll: sejttenyésztő táptalaj Pozitív kontrollok: etil-metánszulfonát, ciklofoszfamid |
|
Tesztelje a vegyszereket |
Sejtkultúra tápközeg, 1% dimetil-szulfoxid, 10% fiziológiás sóoldat, 0,5% tetrahidrofurán, 0,5% etanol |
|
Adatok rögzítése |
Kromoszóma-rendellenességek mikroszkópos értékelése koncentrációban 300 metafázisos sejtben A sejtszám (V79 sejtek) vagy a mitotikus index relatív növekedése, a sejtek életképessége statisztikai értékeléssel meghatározva |
A vizsgálat akkor tekinthető elfogadhatónak, ha mindhárom kísérleti körülményt elvégezzük: rövid távú kezelés metabolikus aktiváció és metabolikus aktiváció nélkül, és hosszú távú kezelés metabolikus aktiváció nélkül negatív eredmények esetén.
|
Első kísérlet (rövid távú inkubáció) és Második kísérlet (hosszan tartó inkubáció) |
|
|
1. nap: Előkészítési nap |
Vérvétel egyetlen donortól és a sejtek beoltása. A perifériás vér limfocitáinak tenyészeteit hasításra indukáljuk egy mitogén (pl. Phytohemagglutinin: PHA) hozzáadásával a táptalajhoz. |
|
3. nap: Tesztelem inkubálása |
A kezeléseket körülbelül 48 órával a tenyésztés megkezdése után kell megkezdeni, amikor a sejtek aktívan szaporodnak. A táptalajt 9% szérumot tartalmazó tápközegre cseréljük, amely a tesztelem és az S25 keverék különböző koncentrációját tartalmazza (csak metabolikus aktiválással). Kezelésből A citotoxicitást és a kicsapódást a tenyészetek kezelési periódusát követően határozzuk meg. |
|
4. nap: Kultúrák előkészítése |
A sejtekből először körülbelül 24 órával később kell mintát venni (a normális sejtciklus idő 1–1.5-szerese). |
|
5. nap: A sejtek festése Giemsával |
Előkészítés után a sejteket tárgylemezeken szétosztjuk. A levegőn szárított tárgylemezeket Giemsa-oldattal festjük, majd mikroszkóposan elemezzük. |
|
6. nap: A metafázis sejtek elemzésének kezdete |
Kromoszóma-rendellenességek: Minden strukturális kromoszóma-rendellenességet, például töréseket, fragmenseket, deléciókat, változásokat és kromoszóma-fragmentációkat rögzítenek. A hiányosságokat is rögzítjük, de az eltérési arány kiszámításakor nem veszik figyelembe. Relatív mitotikus index: A citotoxicitást a mitotikus index (a mitózisban lévő sejtek százalékos aránya, az 1000 sejtre jutó mitotikus sejtek számának kiszámítása) alapján értékelik, és az értékeket összehasonlítják a negatív / oldószer kontrollokkal. Spread Index: A valódi limfocita kultúrák sejtciklusát BrdU jelölési technikával követjük. |
EUROLABjelentési és tanúsítási tevékenységek, Vállalkozási Akkreditációs Alapítvány (EAF) intézménye által biztosított akkreditáció alapján. Vállalati Akkreditációs Alapítvány (EAF) ISO/IEC 17025 laboratóriumi akkreditációs szolgáltató egyidejűleg; Az Egyesült Nemzetek Szervezetének (UN GLOBAL COMPACT) aláírója.
