Scopo, in-vitro Test di aberrazione cromosomica (CA) per identificare le sostanze che causano anomalie cromosomiche strutturali (clastogenesi) 2) 3) 4) È prodotto da vari meccanismi. La maggior parte di questi cambiamenti sarà fatale per la cellula durante i primi cicli cellulari dopo la loro induzione, ma sono usati come indicativi della presenza di cambiamenti non letali come traslocazioni reciproche, inversioni e delezioni minori.
Questi cambiamenti più sottili possono avere conseguenze importanti sia nelle cellule germinali che in quelle somatiche. Pertanto, le mutazioni cromosomiche e gli eventi correlati sono la causa di molte malattie genetiche umane e vi sono prove sostanziali che questi cambiamenti sono implicati nel cancro negli esseri umani e nei sistemi sperimentali. Un altro test per testare la clastogenicità è il Micronucleus Assay.
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protocollo |
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Linee cellulari |
Cellule V79 di criceto cinese o linfociti del sangue periferico umano in coltura stimolata |
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Tre punti |
Determinazione della clastogenicità mediante valutazione microscopica di cellule in metafase Determinazione della vitalità cellulare mediante aumento relativo del numero di cellule (cellule V79) o dell'indice mitotico (linfociti umani) |
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Concentrazioni |
Almeno 3 concentrazioni di elementi di prova considerate in coppia Concentrazioni massime: Sostanze chimiche: 2 mg / mL, 2 µL / mL o 10 mM, a seconda di quale sia il più basso (5 mg / mL / UVCB per componenti non specificati) Dispositivo medico: estratto al 100% Farmaci: 0,5 mg / ml o 1 mM, a seconda di quale sia il più basso |
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Tempo di esposizione |
Esperimento I: 4 ore di incubazione a breve termine Esperimento II: incubazione prolungata di 21 ore (cellule V79) o 24 ore (linfociti umani) |
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Attivazione metabolica |
5% Omogenato di fegato di ratto S9 |
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Controlli di qualità |
Controllo negativo: terreno di coltura cellulare Controlli positivi: etilmetansolfonato, ciclofosfamide |
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Strumenti chimici di prova |
Terreno di coltura cellulare, dimetilsolfossido 1%, soluzione salina fisiologica 10%, tetraidrofurano 0,5%, etanolo 0,5% |
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Raccolta dati |
Valutazione microscopica delle aberrazioni cromosomiche in 300 cellule in metafase per concentrazione Aumento relativo del numero di cellule (cellule V79) o dell'indice mitotico, vitalità cellulare determinata dalla valutazione statistica |
Il test è considerato accettabile quando vengono eseguite tutte e tre le condizioni sperimentali: trattamento a breve termine senza attivazione metabolica e attivazione metabolica e trattamento a lungo termine senza attivazione metabolica in caso di risultati negativi.
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Primo esperimento (incubazione a breve termine) e Secondo esperimento (incubazione prolungata) |
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Giorno 1: giorno di preparazione |
Prelevare il sangue da un singolo donatore e seminare le cellule. Le colture di linfociti del sangue periferico vengono indotte a essere scisse mediante l'aggiunta di un mitogeno (ad es. Fitoemagglutinina: PHA) al terreno di coltura. |
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Giorno 3: incubazione degli elementi di prova |
I trattamenti dovrebbero iniziare circa 48 ore dopo l'inizio della coltura, quando le cellule stanno proliferando attivamente. Il terreno di coltura verrà sostituito con un terreno contenente il 9% di siero contenente diverse concentrazioni di elemento in esame e miscela S25 (solo mediante attivazione metabolica). Di trattamento La citotossicità e la precipitazione saranno determinate dopo il periodo di trattamento delle colture. |
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Giorno 4: preparazione delle culture |
Le cellule dovrebbero essere prima campionate circa 24 ore dopo (1 - 1.5 volte il normale tempo di ciclo cellulare). |
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Giorno 5: Colorazione delle cellule con Giemsa |
Una volta preparate, le cellule vengono distribuite su vetrini. I vetrini essiccati all'aria verranno colorati con la soluzione Giemsa e quindi analizzati al microscopio. |
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Giorno 6: inizio dell'analisi delle cellule metafase |
Aberrazioni cromosomiche: Verranno registrate tutte le aberrazioni cromosomiche strutturali come rotture, frammenti, delezioni, alterazioni e frammentazione cromosomica. Verranno inoltre registrati i gap, ma non saranno inclusi nel calcolo dei tassi di deviazione. Indice mitotico relativo: La citotossicità sarà valutata mediante indice mitotico (percentuale di cellule in mitosi, conteggio del numero di cellule mitotiche per 1000 cellule) e i valori saranno confrontati con controlli negativi / solventi. Indice di diffusione: Il ciclo cellulare di vere colture di linfociti viene monitorato utilizzando una tecnica di etichettatura BrdU. |
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