Test na zvyškovú DNA

Mnoho bunkových substrátov, ktoré sa v súčasnosti používajú na produkty rekombinantnej DNA, monoklonálne protilátky a niektoré vakcíny, je abnormálnych, pretože tieto bunky sú buď tumorogénne, alebo skutočne pochádzajú z nádorov. 

Počas výroby produktov z týchto systémov bunkových kultúr môže dôjsť k lýze buniek. Preto môže byť v produkte prítomná DNA hostiteľskej bunky, ktorá pravdepodobne obsahuje onkogén (y), čo vedie k tumorigénnej udalosti u príjemcu. Produkčné schémy všeobecne zahŕňajú purifikačné postupy, ktoré odstraňujú nukleové kyseliny; stále je však potrebné potvrdiť množstvo zvyškovej hostiteľskej DNA prítomnej vo vzorkách medziproduktu a konečného produktu.

Metódy kvantifikácie zvyškovej DNA

EUROLAB používa vysoko citlivé metódy na detekciu a kvantifikáciu veľmi malého množstva zvyškovej DNA hostiteľskej bunky. Od nešpecifickej detekcie celkovej DNA po detekciu druhovo špecifických cieľových sekvencií ponúkame nasledujúce metódy:

• Prahová skúška - Používa vysokoafinitné proteíny viažuce DNA na jednovláknovú DNA na nešpecifickú kvantifikáciu celkovej DNA

• Hybridizačný test - metóda detekcie špecifickej DNA identifikovaného pôvodu založená na hybridizácii

• qPCR Test - kvantitatívna metóda na detekciu špecifickej DNA identifikovaného pôvodu založená na PCR; zameriava špecifickú génovú sekvenciu na amplifikáciu

príprava vzorky

Bez ohľadu na to, ktorá metóda sa použije na stanovenie zvyškovej DNA, úspešnosť analýzy do značnej miery závisí od spracovania prvej vzorky. Každý test má inú citlivosť na zvyšky (napr. Organické rozpúšťadlá, detergenty, vysoké koncentrácie solí, etanol alebo zvyškové bielkoviny) a je potrebné ho zohľadniť pri predbežnej úprave špecifickej pre matricu. Aby sa zabezpečila kompatibilita s matricou testu a vzorky, mali by sa zvážiť nasledujúce predbežné úpravy: organická extrakcia, ošetrenie proteázou K, magnetické guľôčky, extrakcia Wako bez fenolov alebo iné spôsoby viazania nukleových kyselín na báze kolóny a pomocné zrážacie látky etanolu. Je dôležité poznamenať, že zmeny v procese čistenia produktu ovplyvňujú matricu vzorky a môžu následne ovplyvniť testovaciu metódu.

Validácia testu

Podľa pokynov Medzinárodnej konferencie o harmonizácii (ICH) všetky kvantitatívne testy vyžadujú validáciu presnosti, presnosti, detekčných a kvantifikačných limitov, linearity a špecifickosti. V súlade s pokynmi ICH overujeme naše testy DNA pomocou štandardnej matice a v neskoršej klinickej fáze vykonávame validácie špecifické pre vzorky požadované pre produkty.