Účel, in-vitro Test chromozómovej aberácie (CA) na identifikáciu látok, ktoré spôsobujú štrukturálne abnormality chromozómov (klastogenéza) 2) 3) 4) Vyrába sa rôznymi mechanizmami. Väčšina z týchto zmien bude pre bunky smrteľných počas niekoľkých prvých bunkových cyklov po ich indukcii, ale používajú sa ako indikácia prítomnosti neletálnych zmien, ako sú recipročné translokácie, inverzie a drobné delécie.
Tieto jemnejšie zmeny môžu mať významné následky v zárodočných aj somatických bunkách. Chromozomálne mutácie a súvisiace udalosti sú teda príčinou mnohých genetických chorôb človeka a existujú značné dôkazy o tom, že tieto zmeny majú vplyv na rakovinu u ľudí a experimentálnych systémov. Ďalším testom na testovanie klastogenity je test Micronucleus.
|
protokol |
|
|
Bunkové línie |
Bunky čínskeho škrečka V79 alebo stimulované kultivované ľudské periférne krvné lymfocyty |
|
Tri body |
Stanovenie klastogenicity mikroskopickým hodnotením buniek metafázy Stanovenie životaschopnosti buniek relatívnym zvýšením počtu buniek (bunky V79) alebo mitotickým indexom (ľudské lymfocyty) |
|
Koncentrácie |
Najmenej 3 koncentrácie testovanej látky uvažované v pároch Maximálne koncentrácie: Chemikálie: 2 mg / ml, 2 µL / ml alebo 10 mM, podľa toho, ktorá hodnota je najnižšia (5 mg / ml / UVCB pre nešpecifikované zložky) Zdravotnícka pomôcka: 100% extrakt Lieky: 0,5 mg / ml alebo 1 mM, podľa toho, ktorá hodnota je nižšia |
|
Doba vystavenia |
Pokus I: 4 hodiny krátkodobej inkubácie Pokus II: 21 hodín (bunky V79) alebo 24 hodín (ľudské lymfocyty) predĺžená inkubácia |
|
Metabolická aktivácia |
5% homogenát pečeňových potkanov S9 |
|
Kontroly kvality |
Negatívna kontrola: kultivačné médium pre bunky Pozitívne kontroly: etylmetánsulfonát, cyklofosfamid |
|
Nástroje na testovanie chemikálií |
Médium pre bunkovú kultúru, 1% dimetylsulfoxid, 10% fyziologický roztok, 0,5% tetrahydrofurán, 0,5% etanol |
|
Zber dát |
Mikroskopické hodnotenie chromozomálnych aberácií v 300 metafázových bunkách na koncentráciu Relatívne zvýšenie počtu buniek (bunky V79) alebo mitotický index, životaschopnosť buniek stanovená štatistickým vyhodnotením |
Skúška sa považuje za prijateľnú, ak sa vykonajú všetky tri experimentálne podmienky: krátkodobá liečba bez metabolickej aktivácie a metabolickej aktivácie a dlhodobá liečba bez metabolickej aktivácie v prípade negatívnych výsledkov.
|
Prvý experiment (krátkodobá inkubácia) a Druhý experiment (predĺžená inkubácia) |
|
|
1. deň: Prípravný deň |
Odber krvi od jediného darcu a výsev buniek. Kultúry lymfocytov periférnej krvi sa indukujú štiepením pridaním mitogénu (napr. Fytohemaglutinín: PHA) do kultivačného média. |
|
Deň 3: Inkubácia testovanej položky |
Liečba sa má začať približne 48 hodín po začiatku kultivácie, keď sa bunky aktívne množia. Kultivačné médium bude nahradené médiom obsahujúcim 9% séra obsahujúce rôzne koncentrácie testovanej látky a zmesi S25 (iba metabolickou aktiváciou). Liečba Cytotoxicita a zrážanie sa stanovia po dobe pôsobenia kultúr. |
|
4. deň: Príprava kultúr |
Z buniek by sa mali najskôr odobrať vzorky približne o 24 hodín neskôr (1 - 1.5-násobok bežného času bunkového cyklu). |
|
5. deň: Farbenie buniek pomocou Giemsy |
Po príprave sa bunky rozložia na podložné sklíčka. Na vzduchu sušené podložné sklíčka sa zafarbia roztokom Giemsa a potom sa analyzujú mikroskopicky. |
|
Deň 6: Začiatok analýzy buniek metafázy |
Chromozomálne aberácie: Zaznamenajú sa všetky štrukturálne chromozómové aberácie, ako sú zlomy, fragmenty, delécie, zmeny a fragmentácia chromozómov. Zaznamenajú sa tiež medzery, ktoré sa však nezapočítavajú do výpočtu mier odchýlok. Relatívny mitotický index: Cytotoxicita sa vyhodnotí mitotickým indexom (percento buniek v mitóze, počet mitotických buniek na 1000 XNUMX buniek) a hodnoty sa porovnajú s negatívnymi / rozpúšťadlovými kontrolami. Spread Index: Bunkový cyklus pravých lymfocytových kultúr sa monitoruje pomocou techniky označovania BrdU. |
EUROLABspravodajské a certifikačné činnosti, Enterprise Accreditation Foundation (EAF) na základe akreditácie poskytnutej jej inštitúciou. Enterprise Accreditation Foundation (EAF) zároveň poskytovateľ akreditácie laboratórií ISO/IEC 17025; Je signatárom Organizácie Spojených národov (UN GLOBAL COMPACT).
