Kromozom Sapma Testi

Kromozom Sapma Testi

Amacı, in-vitro kromozom sapması (CA) testi yapısal kromozom anormallikleri (clastogenesis) neden olan maddelerin belirlenmesi için 2) 3) 4) çeşitli mekanizmalar ile üretilir. Bu değişikliklerin çoğu, indüksiyonlarından sonraki ilk birkaç hücre döngüsü sırasında hücre için ölümcül olacaktır, ancak karşılıklı translokasyonlar, inversiyonlar ve küçük silmeler gibi ölümcül olmayan değişikliklerin varlığının göstergesi olarak kullanılmaktadır. 

Kromozom Sapma Testi

Bu daha ince değişikliklerin hem germ hem de somatik hücrelerde önemli sonuçları olabilir. Dolayısıyla, kromozomal mutasyonlar ve ilgili olaylar birçok insan genetik hastalığının sebebidir ve bu değişikliklerin insanlarda ve deneysel sistemlerde kansere karıştığına dair önemli kanıtlar vardır. Klastojenisiteyi test etmek için başka bir tahlil, Mikronükleus Deneyidir.

Deneysel Performans

Protokol

Hücre hatları

Çin Hamster V79 hücreleri veya

uyarılmış kültürlenmiş insan periferik kan lenfositleri

Uç nokta

Metafaz hücrelerinin mikroskobik değerlendirmesiyle klastojenisitenin tespiti

Hücre sayısında (V79 hücreleri) veya mitotik indekste (insan lenfositleri) göreceli artışla hücre canlılığı tayini

Konsantrasyonlar

Çift olarak değerlendirilen en az 3 test öğesi konsantrasyonu

Maksimum konsantrasyonlar:

· Kimyasallar: 2 mg / mL, 2 µL / mL veya 10 mM, hangisi en düşükse (tanımlanmamış bileşenler için 5 mg / mL / UVCB)

· Tıbbi cihaz:% 100 özüt

· İlaçlar: 0,5 mg / mL veya 1 mM, hangisi en düşükse

Maruziyet süresi

Deney I: 4 saat kısa süreli inkübasyon

Deney II: 21 saat (V79 hücreleri) veya 24 saat (insan lenfositleri) uzun süreli inkübasyon

Metabolik aktivasyon

% 5 Sıçan karaciğeri homojenatı S9

Kalite kontrolleri

Negatif kontrol: hücre kültürü ortamı

Pozitif kontroller: etilmetansülfonat, siklofosfamid

Test kimyasalları araçları

Hücre kültürü ortamı,% 1 dimetilsülfoksid,% 10 fizyolojik salin,% 0,5 tetrahidrofuran,% 0,5 etanol

Veri yakalama

Konsantrasyon başına 300 metafaz hücresindeki kromozomal sapmaların mikroskobik değerlendirmesi

Hücre sayısında (V79 hücreleri) veya mitotik indekste göreceli artış, istatistiksel değerlendirme ile belirlenen hücre canlılığı

Test prosedürü (insan lenfositleri)

Üç deneysel koşulun tamamı yürütüldüğünde tahlil kabul edilebilir olarak kabul edilir: metabolik aktivasyon olmadan ve metabolik aktivasyon ile kısa süreli tedavi ve negatif sonuçlar durumunda metabolik aktivasyon olmadan uzun süreli tedavi.

İlk Deney (kısa süreli inkübasyon) ve İkinci Deney (uzun süreli inkübasyon)

1. Gün: Hazırlık günü

Tek bir donörden kan alınması ve hücrelerin tohumlanması. Periferal kan lenfositlerinin kültürleri, kültür ortamına bir mitojen (örn. Fitohemaglutinin: PHA) ilavesiyle bölünmek üzere uyarılır.

3. Gün: Test Öğesi İnkübasyonu

Tedaviler, hücreler aktif olarak çoğaldığında kültür başladıktan yaklaşık 48 saat sonra başlamalıdır.

Kültür ortamı, farklı konsantrasyonlarda test öğesi ve S9 karışımı içeren% 25 serum içeren ortamla değiştirilecektir (yalnızca metabolik aktivasyon ile).

Tedavinin
başlaması Kısa süreli tedavi için 4 saat ve uzun süreli tedavi için 24 saat inkübasyon. Ek negatif ve / veya çözücü ve pozitif kontroller aynı şekilde muamele edilir.

Kültürlerin tedavi süresinden sonra sitotoksisite ve çökelme belirlenecektir.

4. Gün: Kültürlerin Hazırlanması

Hücreler ilk önce yaklaşık 24 saat sonra (normal hücre döngü süresinin 1 - 1.5 katı) örneklenmelidir.

5. Gün: Giemsa ile Hücrelerin Boyanması

Hazırlandıktan sonra hücreler slaytlara yayılır. Havayla kurutulmuş slaytlar Giemsa solüsyonu ile boyanacak ve daha sonra mikroskobik olarak analiz edilecektir.

6. Gün: Metafaz Hücrelerinin Analiz Başlangıcı

Kromozomal sapmalar:

Kırılmalar, parçalar, silmeler, değişimler ve kromozomal parçalanma gibi tüm yapısal kromozom sapmaları kaydedilecektir. Boşluklar da kaydedilecek, ancak sapma oranlarının hesaplanmasına dahil edilmeyecektir.

Bağıl Mitotik İndeks:

Sitotoksisite, mitotik indeksle (mitozdaki hücre yüzdesi, 1000 hücrede mitotik hücre sayısı sayılarak) değerlendirilecek ve değerler, negatif / solvent kontrolleri ile karşılaştırılacaktır.

Yayılma Endeksi:

Gerçek lenfosit kültürlerinin hücre döngüsü, bir BrdU etiketleme tekniği kullanılarak izlenir.

Copyright © 2020 | EUROLAB Laboratory Services | Her Hakkı Saklıdır.