Amacı, in-vitro kromozom sapması (CA) testi yapısal kromozom anormallikleri (clastogenesis) neden olan maddelerin belirlenmesi için 2) 3) 4) çeşitli mekanizmalar ile üretilir. Bu değişikliklerin çoğu, indüksiyonlarından sonraki ilk birkaç hücre döngüsü sırasında hücre için ölümcül olacaktır, ancak karşılıklı translokasyonlar, inversiyonlar ve küçük silmeler gibi ölümcül olmayan değişikliklerin varlığının göstergesi olarak kullanılmaktadır.
Bu daha ince değişikliklerin hem germ hem de somatik hücrelerde önemli sonuçları olabilir. Dolayısıyla, kromozomal mutasyonlar ve ilgili olaylar birçok insan genetik hastalığının sebebidir ve bu değişikliklerin insanlarda ve deneysel sistemlerde kansere karıştığına dair önemli kanıtlar vardır. Klastojenisiteyi test etmek için başka bir tahlil, Mikronükleus Deneyidir.
|
Protokol |
|
|
Hücre hatları |
Çin Hamster V79 hücreleri veya uyarılmış kültürlenmiş insan periferik kan lenfositleri |
|
Uç nokta |
Metafaz hücrelerinin mikroskobik değerlendirmesiyle klastojenisitenin tespiti Hücre sayısında (V79 hücreleri) veya mitotik indekste (insan lenfositleri) göreceli artışla hücre canlılığı tayini |
|
Konsantrasyonlar |
Çift olarak değerlendirilen en az 3 test öğesi konsantrasyonu Maksimum konsantrasyonlar: · Kimyasallar: 2 mg / mL, 2 µL / mL veya 10 mM, hangisi en düşükse (tanımlanmamış bileşenler için 5 mg / mL / UVCB) · Tıbbi cihaz:% 100 özüt · İlaçlar: 0,5 mg / mL veya 1 mM, hangisi en düşükse |
|
Maruziyet süresi |
Deney I: 4 saat kısa süreli inkübasyon Deney II: 21 saat (V79 hücreleri) veya 24 saat (insan lenfositleri) uzun süreli inkübasyon |
|
Metabolik aktivasyon |
% 5 Sıçan karaciğeri homojenatı S9 |
|
Kalite kontrolleri |
Negatif kontrol: hücre kültürü ortamı Pozitif kontroller: etilmetansülfonat, siklofosfamid |
|
Test kimyasalları araçları |
Hücre kültürü ortamı,% 1 dimetilsülfoksid,% 10 fizyolojik salin,% 0,5 tetrahidrofuran,% 0,5 etanol |
|
Veri yakalama |
Konsantrasyon başına 300 metafaz hücresindeki kromozomal sapmaların mikroskobik değerlendirmesi Hücre sayısında (V79 hücreleri) veya mitotik indekste göreceli artış, istatistiksel değerlendirme ile belirlenen hücre canlılığı |
Üç deneysel koşulun tamamı yürütüldüğünde tahlil kabul edilebilir olarak kabul edilir: metabolik aktivasyon olmadan ve metabolik aktivasyon ile kısa süreli tedavi ve negatif sonuçlar durumunda metabolik aktivasyon olmadan uzun süreli tedavi.
|
İlk Deney (kısa süreli inkübasyon) ve İkinci Deney (uzun süreli inkübasyon) |
|
|
1. Gün: Hazırlık günü |
Tek bir donörden kan alınması ve hücrelerin tohumlanması. Periferal kan lenfositlerinin kültürleri, kültür ortamına bir mitojen (örn. Fitohemaglutinin: PHA) ilavesiyle bölünmek üzere uyarılır. |
|
3. Gün: Test Öğesi İnkübasyonu |
Tedaviler, hücreler aktif olarak çoğaldığında kültür başladıktan yaklaşık 48 saat sonra başlamalıdır. Kültür ortamı, farklı konsantrasyonlarda test öğesi ve S9 karışımı içeren% 25 serum içeren ortamla değiştirilecektir (yalnızca metabolik aktivasyon ile). Tedavinin Kültürlerin tedavi süresinden sonra sitotoksisite ve çökelme belirlenecektir. |
|
4. Gün: Kültürlerin Hazırlanması |
Hücreler ilk önce yaklaşık 24 saat sonra (normal hücre döngü süresinin 1 - 1.5 katı) örneklenmelidir. |
|
5. Gün: Giemsa ile Hücrelerin Boyanması |
Hazırlandıktan sonra hücreler slaytlara yayılır. Havayla kurutulmuş slaytlar Giemsa solüsyonu ile boyanacak ve daha sonra mikroskobik olarak analiz edilecektir. |
|
6. Gün: Metafaz Hücrelerinin Analiz Başlangıcı |
Kromozomal sapmalar: Kırılmalar, parçalar, silmeler, değişimler ve kromozomal parçalanma gibi tüm yapısal kromozom sapmaları kaydedilecektir. Boşluklar da kaydedilecek, ancak sapma oranlarının hesaplanmasına dahil edilmeyecektir. Bağıl Mitotik İndeks: Sitotoksisite, mitotik indeksle (mitozdaki hücre yüzdesi, 1000 hücrede mitotik hücre sayısı sayılarak) değerlendirilecek ve değerler, negatif / solvent kontrolleri ile karşılaştırılacaktır. Yayılma Endeksi: Gerçek lenfosit kültürlerinin hücre döngüsü, bir BrdU etiketleme tekniği kullanılarak izlenir. |
EUROLAB, raporlama ve belgelendirme faaliyetlerini, Enterprise Accreditation Foundation (EAF) kuruluşundan sağladığı akreditasyona dayanarak sürdürmektedir. Enterprise Accreditation Foundation (EAF) ISO/IEC 17025 laboratuvar akreditasyon sağlayıcısı aynı zamanda; Birleşmiş Milletler (UN GLOBAL COMPACT) imzacısıdır.
