BCA Boyamalı Sitotoksisite Testi

BCA Boyamalı Sitotoksisite Testi

BCA reaktifleri, suda çözünür ve stabil bir BCA (bisinkoninik asit) ve bir alkalin Cu2 + solüsyonundan oluşur.

BCA Boyamalı Sitotoksisite Testi

Her hücrenin bir bileşeni olan sistein, sistin, triptofan ve tirozin amino asitleri bu reaktiflere bağlanır ve bu süreçte Cu2 + ' yi Cu +' ya düşürür . Cu + daha sonra bisinkoninik aside bağlanarak suda çözünür mor bir boya oluşturur.

Mor boyanın yoğunluğu, absorbans tarafından izlendiği gibi kültürdeki hücre sayısı ile ilişkilidir.

Ekstraksiyon yöntemi ve BCA Boyama ile hücrelerin büyüme inhibisyonunun değerlendirilmesi

  • Test öğesi, 37 ± 1 ° C'de% 10 FBS ile desteklenen DMEM'de belirli bir süre çalkalama altında ekstrakte edilir ve L929 hücreleri ekstrakt ile inkübe edilir.
  • Kuluçka süresinin bitiminden kısa bir süre önce hücreler mikroskobik olarak değerlendirilir.
  • İnkübasyondan sonra hücreler bir tamponla yıkanır ve ardından BCA reaktifleri eklenir. Hücreler bu reaktiflerle 0.5 - 2 saat inkübe edilir ve absorbans 550 nm'de belirlenir.
  • ISO 10993-5'e göre sitotoksik etkiler, hücre büyümesi için bir ölçü olarak kullanılan kültürlerin protein içeriğine göre değerlendirilebilir. Muamele edilmemiş kontrol kültürleri (çözücü kontrolü) ile karşılaştırıldığında% 30'dan fazla test ekstresi ile muamele edilen kültürlerin büyüme inhibisyonu, açık bir sitotoksik etki olarak kabul edilir.

Protokol

Hücre çizgisi

L929 hücreleri (ATCC No. CCL1, NCTC klon 929 (bağ dokusu fare), L suşunun klonu (DSMZ))

Analiz

BCA testi iki reaksiyondan oluşur:

1. Protein peptit bağları Cu2 + iyonlarını Cu + 'ya

düşürür 2. İki bisinkoninik asit molekülü, bir Cu + iyonu ile şelatlaşarak 550 nm dalga boyunda ışığı absorbe eden mor bir kompleks oluşturur

Konsantrasyonlar

4 test özütü konsantrasyonu:% 29.6,% 44.4,% 66.7 ve% 100

Ekstraksiyon süresi

37 ± 1 ° C'de 4-72 saat

- 4 saat (kısa süreli temas ve sağlam cilt veya mukoza)
24 ± 2 saat (kısa süreli ve hastayla sınırlı temas)
72 ± 2 saat (uzun süreli ve kalıcı temas)

Kuluçka süresi

37 ± 1 ° C'de 24-72 saat

Kalite kontrolleri

Solvent Kontrolü: DMEM% 10 FBS

Negatif kontrol: DMEM% 10 FBS'de ekstrakte edilmiş polipropilen

Pozitif kontrol: DMEM% 10 FBS'de ekstrakte edilen lateks

Veri teslimi

L929 hücrelerinin Büyüme İnhibisyonu, 550 nm absorbansta protein içeriği ölçülerek belirlenir

Olumlu tahmin

Muamele edilmemiş kontrol kültürlerine (çözücü kontrolü) kıyasla% 30'dan fazla test ekstresi ile muamele edilen kültürlerin büyüme inhibisyonu, berrak bir sitotoksik etki olarak kabul edilir.

Copyright © 2020 | EUROLAB Laboratory Services | Her Hakkı Saklıdır.