โปรโตคอล

เส้นเซลล์

เซลล์หนูแฮมสเตอร์จีน V79 หรือ

กระตุ้นเซลล์เม็ดเลือดขาวในเลือดของมนุษย์ที่ได้รับการเพาะเลี้ยง

สามจุด

การกำหนดความสามารถในการเกิด clastogenicity โดยการประเมินด้วยกล้องจุลทรรศน์ของเซลล์ metaphase

การกำหนดความมีชีวิตของเซลล์โดยการเพิ่มขึ้นของจำนวนเซลล์ (เซลล์ V79) หรือดัชนี mitotic (เซลล์เม็ดเลือดขาวของมนุษย์)

ความเข้มข้น

ความเข้มข้นของรายการทดสอบอย่างน้อย 3 รายการประเมินเป็นคู่

ความเข้มข้นสูงสุด:

สารเคมี: 2 mg / mL, 2 µL / mL หรือ 10 mM แล้วแต่จำนวนใดจะต่ำที่สุด (5 mg / mL / UVCB สำหรับส่วนประกอบที่ไม่ระบุ)

อุปกรณ์ทางการแพทย์: สารสกัด 100%

ยา: 0,5 มก. / มล. หรือ 1 มม. แล้วแต่จำนวนใดจะต่ำที่สุด

เวลารับสัมผัสเชื้อ

การทดลองที่ 4: การฟักตัวระยะสั้น XNUMX ชั่วโมง

การทดลองที่ 21: 79 ชั่วโมง (เซลล์ V24) หรือ XNUMX ชั่วโมง (เซลล์เม็ดเลือดขาวของมนุษย์) ใช้เวลาฟักตัวเป็นเวลานาน

การกระตุ้นการเผาผลาญ

5% ตับหนูทำให้เป็นเนื้อเดียวกัน S9

การตรวจสอบคุณภาพ

การควบคุมเชิงลบ: อาหารเลี้ยงเซลล์

การควบคุมเชิงบวก: ethylmethanesulfonate, cyclophosphamide

ทดสอบเครื่องมือเคมี

อาหารเลี้ยงเซลล์, ไดเมทิลซัลฟอกไซด์ 1%, น้ำเกลือทางสรีรวิทยา 10%, เตตระไฮโดรฟูแรน 0,5%, เอทานอล 0,5%

การจับข้อมูล

การประเมินความผิดปกติของโครโมโซมด้วยกล้องจุลทรรศน์ในเซลล์เมตาเฟส 300 เซลล์ต่อความเข้มข้น

การเพิ่มขึ้นของจำนวนเซลล์ (เซลล์ V79) หรือดัชนีไมโทติกความมีชีวิตของเซลล์ที่กำหนดโดยการประเมินทางสถิติ

การทดลองครั้งแรก (การบ่มเพาะในเวลาสั้น ๆ ) และ การทดลองครั้งที่สอง (การฟักตัวเป็นเวลานาน)

วันที่ 1: วันเตรียมการ

รับเลือดจากผู้บริจาครายเดียวและเพาะเซลล์ การเพาะเลี้ยงลิมโฟไซต์ในเลือดส่วนปลายถูกกระตุ้นให้แยกออกโดยการเติมไมโตเจน (เช่น Phytohemagglutinin: PHA) ลงในอาหารเลี้ยงเชื้อ

วันที่ 3: การบ่มเพาะไอเทมทดสอบ

การรักษาควรเริ่มประมาณ 48 ชั่วโมงหลังจากการเพาะเลี้ยงเริ่มขึ้นเมื่อเซลล์มีการแพร่กระจายอย่างรวดเร็ว

อาหารเลี้ยงเชื้อจะถูกแทนที่ด้วยอาหารเลี้ยงเชื้อที่มีซีรั่ม 9% ที่มีความเข้มข้นของรายการทดสอบที่แตกต่างกันและส่วนผสมของ S25 (โดยการกระตุ้นการเผาผลาญเท่านั้น)

ของการรักษา
การฟักตัวเป็นเวลา 4 ชั่วโมงสำหรับการบำบัดระยะสั้นและ 24 ชั่วโมงสำหรับการบำบัดระยะยาว การควบคุมเชิงลบและ / หรือตัวทำละลายและบวกเพิ่มเติมจะได้รับการปฏิบัติในลักษณะเดียวกัน

ความเป็นพิษต่อเซลล์และการตกตะกอนจะถูกกำหนดหลังจากระยะเวลาการรักษาของวัฒนธรรม

วันที่ 4: การเตรียมวัฒนธรรม

ควรสุ่มตัวอย่างเซลล์ก่อนประมาณ 24 ชั่วโมงหลังจากนั้น (1 - 1.5 เท่าของรอบเซลล์ปกติ)

วันที่ 5: ย้อมสีเซลล์ด้วย Giemsa

หลังจากเตรียมการแล้วเซลล์จะกระจายไปบนสไลด์ สไลด์แห้งด้วยอากาศจะถูกย้อมด้วยสารละลาย Giemsa และวิเคราะห์ด้วยกล้องจุลทรรศน์

วันที่ 6: เริ่มการวิเคราะห์ Metaphase Cells

ความผิดปกติของโครโมโซม:

ความผิดปกติของโครงสร้างโครโมโซมทั้งหมดเช่นการแตกชิ้นส่วนการลบการเปลี่ยนแปลงและการแตกตัวของโครโมโซมจะถูกบันทึกไว้ ช่องว่างจะถูกบันทึกด้วย แต่จะไม่รวมอยู่ในการคำนวณอัตราการเบี่ยงเบน

ดัชนี Mitotic สัมพัทธ์:

ความเป็นพิษต่อเซลล์จะได้รับการประเมินโดยดัชนีไมโทซิส (เปอร์เซ็นต์ของเซลล์ในไมโทซิสนับจำนวนเซลล์ไมโทซิสต่อเซลล์ 1000 เซลล์) และค่าต่างๆจะถูกเปรียบเทียบกับการควบคุมเชิงลบ / ตัวทำละลาย

ดัชนีสเปรด:

วงจรเซลล์ของการเพาะเลี้ยงลิมโฟไซต์ที่แท้จริงได้รับการตรวจสอบโดยใช้เทคนิคการติดฉลาก BrdU